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免疫組化常用的染色方法
 

根據標記物的不同分為免疫熒光法,免疫酶標法,親和組織化學法,后者是以一種物質對某種組織成分具有高度親合力為基礎的檢測方法。這種方法敏感性更高,有利于微量抗原(抗體)在細胞或亞細胞水平的定位,其中生物素——抗生物素染色法最常用。

 
免疫組織化學染色方法 IHC染色方法有很多種,按部標記物的性質可分為熒光法(熒光素標記),酶法(辣根過氧化物酶,堿性磷酸酶),免疫金銀及鐵標記技術等;按染色步驟可分為直接法(又稱一步法)和間接法(二步,三步或多步法);按結合方式可分為抗原-抗體結合,如PAP法和標記的葡聚糖聚合物(labeled dextran polymer,LDP)法,以及親和連接,如ABC法、標記的鏈親和素-生物素(labeled streptoavidin-biotin ,LSAB)法等,其中LSAB是最常用的使用方法。


影響免疫組化染色質量的因素很多,在實驗中應注意組織的取材和固定,選擇質量好的商品化抗體,恰當的選擇和使用封閉和抗原修復手段,嚴格的技術操作和對照等。由于組織內待測抗原已被分解破壞,或抗原含量過低、或固定劑的使用不當及抗體質量不佳和稀釋度不當等可出現假陰性反應;反之,由于抗體與非待檢抗原發生交叉反應,或組織對抗體的非特異性吸附及內源性過氧化酶(endogenousperoxidase)沒有被阻斷等還可出現假陽性結果。這些可造成判斷的失誤。

 

免疫組織化學染色


SP法
1、脫蠟水化
2、蒸餾水中5分鐘
3、用蒸餾水或PBS配置新鮮的3%H2O2室溫封閉10分鐘蒸餾水洗1次
4、抗原修復
5、PBS洗5分鐘
6、滴加正常山羊血清封閉液,室溫10分鐘
7、甩去多余液體滴加抗371小時或者4過夜4過夜后在37復溫45分鐘
8、PBS洗2次各5分鐘
9、滴加生物素化抗孵育條件參見所用試劑盒
10、PBS洗2次各5分鐘
11、滴加酶標抗體孵育條件參見所用試劑盒
12、PBS洗2次各5分鐘
13、DAB顯色510分鐘在顯微鏡下掌握染色程度
14、蒸餾水洗終止染色蘇木素復染鹽酸酒精分化
15、脫水透明封片鏡檢

SABC法
1、脫蠟水化
2、蒸餾水中5分鐘
3、用蒸餾水或PBS配置新鮮的3%H2O2室溫封閉510分鐘蒸餾水洗1次
4、抗原修復
5、PBS洗5分鐘
6、滴加正常山羊血清封閉液室溫10-20分鐘甩去多余液體
7、滴加抗,371小時或者4過夜4過夜后在37復溫30分鐘
8、PBS洗2次每次5分鐘
9、滴加生物素化二抗孵育條件參見所用試劑盒
10、PBC洗2次每次5分鐘
11、滴加試劑SABC孵育條件參見所用試劑盒
12、PBS洗2次每次5分鐘
13、DAB顯色DAB顯色試劑盒或者自配顯色劑顯色鏡下掌握顯色程度
14、蒸餾水洗終止染色蘇木素復染鹽酸酒精分化
15、脫水透明封片鏡檢

 

 
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